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La tubercolosi è una malattia infettiva causata dal batterio Mycobacterium tuberculosis ed è una malattia respiratoria caratterizzata da formazioni tuberose, necrosi, ascessi, fibrosi e calcificazioni polmonari. Può anche infettare i reni, i linfonodi, le ossa, le articolazioni e la pelle.
La diagnosi di laboratorio primaria di questo bacillo comporta la colorazione per visualizzare i batteri al microscopio. Il campione di scelta è l'espettorato o il lavaggio broncoalveolare per identificare un'infezione respiratoria o un campione di tessuto reale.
Fisiologia
Il Mycobacterium tuberculosis è un organismo a forma di bastoncello (bacilli), spora non mobile e non obbligatoria. Questo batterio misura 0,4x3 micrometri di lunghezza e subisce la fissione binaria (divisione della cellula riproduttiva) ogni 15-24 ore, che è considerata lenta rispetto ad altri batteri. Per questo motivo, il micobatterio può richiedere fino a nove settimane prima che compaia nel terreno di coltura.
Questo organismo è sensibile alla luce UV e al calore (come la pastorizzazione), ma resiste ai disinfettanti chimici.
Colorazione di Gram
Il Mycobacterium tuberculosis non può essere veramente classificato come gram-positivo o gram-negativo. Questa classificazione è basata sulla quantità di peptidoglicano nella parete cellulare di un batterio. Una specie gram-positiva ha uno spesso strato di questa molecola (circa il 90%), mentre una specie gram-negativa ha uno strato sottile (dal 5% al 20%). Le macchie di Gram penetrano nella parete cellulare e si legano ai componenti chimici in essa contenuti. Al microscopio, i batteri colorati diventeranno viola o rosa.
Con il micobatterio tubercolosi, la parete cellulare è composta da peptidoglicano, ma anche lipidi complessi che inibiscono la penetrazione del colorante grammo. La parete cellulare resiste anche allo scolorimento da acido o alcol, motivo per cui il micobatterio è chiamato "resistente agli acidi". I lipidi della parete cellulare sono l'acido micolico, il fattore stringa e la cera D. Se i batteri dovessero essere macchiati, le cellule apparirebbero gram-positive o leggermente pallide con pochissimo colore.
Per vedere i batteri, è necessario utilizzare macchie speciali, come Aumarine o Zhiel-Neelson.
Colorazione aumarina-rodamina
Il processo che utilizza l'auramina-rodamina utilizza un colorante fluorescente giallo per visualizzare il micobatterio tubercolosi al microscopio a fluorescenza. Il permanganato di potassio o l'arancio di acridina possono essere usati come colorante di contrasto. Sotto la lente, le cellule batteriche appariranno verdi.
Il colorante auramina-rodamina è più sensibile di Zhiel-Neelson e più economicamente sostenibile.
Colorazione Ziehl-Neelson
La colorazione Ziehl-Neelson è stata creata dagli scienziati Franz Ziehl e Friedrich Neelsen e utilizza carbol-fuchsin riscaldata, un'alta concentrazione di acido-alcol e un colorante di contrasto, come la malachite verde o il blu di metilene. Sotto un microscopio a fluorescenza, le cellule batteriche appariranno di un rosa brillante.
Il colorante Ziehl-Neelson è lo standard di eccellenza per l'identificazione preliminare di Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae.
Agar
Secondario all'identificazione della microscopia, il micobatterio tubercolosi deve essere coltivato su una speciale coltura di agar. La gelatina Lowenstein-Jensen contiene sostanze organiche complesse (come uova e patate), sali, glicerolo e verde malachite (che inibisce altri batteri). Gli antibiotici possono essere aggiunti per inibire ulteriormente i microrganismi contaminanti. Il campione viene posto su questo agar ei batteri crescono in tre-nove settimane.
Una soluzione di coltura nutritiva, come l'albumina e la biotina, può essere utilizzata per supportare la crescita anche della più piccola quantità di batteri bersaglio. Questo è noto come Middlebrook 7H9 (o 7H12).
In entrambi i terreni, le colonie appariranno come piccole colonie lucide di colore marrone chiaro.
Con la tecnologia avanzata, il micobatterio tubercolosi può ora essere coltivato utilizzando un lettore automatizzato. Una soluzione liquida di mezzo Middlebrook 7H9 e un composto indicatore fluorescente vengono utilizzati per monitorare la crescita e segnalare un'infezione positiva o negativa.