Contenuto
Le tecniche di elettroforesi separano le molecole di DNA in base alle loro dimensioni; tecniche simili per le proteine possono separarle in base alle dimensioni o alla carica. In entrambi i casi, il gel attraverso il quale le molecole migrano viene preparato utilizzando una soluzione tampone, una sostanza chimica che agisce per stabilizzare il pH. Il cappuccio svolge diversi ruoli vitali nell'elettroforesi.
corrente
Il gel per elettroforesi funziona applicando una corrente elettrica alla piastra di gel immersa nel buffer. Le molecole di DNA sono caricate negativamente e le proteine possono essere caricate negativamente denaturandole prima e poi trattandole con sodio dodecil solfato (SDS). Proteine o molecole di DNA migrano dal catodo caricato negativamente all'anodo caricato positivamente. L'acqua, tuttavia, è un veicolo piuttosto povero in corrente - porta soltanto corrente efficacemente quando dissolve le sostanze in esso, mentre gli ioni caricati si muovono in un campo elettrico. La soluzione tampone ha una maggiore concentrazione di ioni (maggiore forza ionica), quindi può trasportare molto più corrente dell'acqua pura.
Cambiamento del PH
Il pH misura la concentrazione dello ione idrogeno. Il cambiamento di pH può modificare la carica netta di molecole, come proteine o DNA, causando una migrazione più lenta (o più veloce). Questo perché queste molecole hanno parti base che accettano ioni idrogeno (protoni) e molte parti acide che possono donare protoni. Quando un acido dona un protone, diventa negativamente carico; quando una base accetta un protone, al contrario, riceve una carica positiva. Quando la concentrazione di ioni idrogeno nella soluzione aumenta, le proteine e il DNA diventano meno carichi negativamente (o più caricati positivamente). Il pH a cui una molecola, come la proteina, non ha carica è chiamato punto isoelettrico. I tamponi stabilizzano il pH nel gel a un livello in cui il DNA sarà caricato negativamente e migrerà come desiderato.
Gel impilabile
I tamponi svolgono un ruolo ancora più complesso in una sorta di elettroforesi chiamata SDS-PAGE, o sodio dodecil solfato, elettroforesi su gel di poliacrilammide. Questa è una delle tecniche più comuni per l'analisi delle proteine. Essi vengono denaturati mediante trattamento termico e quindi rivestiti con sodio dodecil solfato e solo successivamente aggiunti al gel, che generalmente scorre verticalmente. Il gel ha due regioni, quella di impilamento (nella parte superiore) e quella di scorrimento sottostante. Il gel di impilamento è preparato con un tampone diverso in modo che il suo pH sia inferiore a quello del gel corrente, inoltre ha una forza ionica minore. Questi due fattori causano l'accatastamento della proteina, quindi va tutto nel gel in funzione allo stesso tempo. Questo effetto aiuta a garantire la separazione delle proteine nel gel in base alle loro dimensioni.
Elettroforesi del DNA del cappuccio
I due buffer più comuni per l'elettroforesi su gel di DNA sono l'EDTA tris-acetato e l'EDTA trisborato, dove EDTA sta per acido etilendiamminotetracetico. È importante perché funge da chelatore per gli ioni di magnesio, rimuovendoli dalla soluzione. Questi ioni sono cofattori essenziali per gli enzimi chiamati DNA che rompono il DNA, quindi l'EDTA nel buffer funge da precauzione aggiuntiva per prevenire qualsiasi problema con il DNA.