Contenuto
- Rilevamento tramite cambi di colore
- Utilizzo di un lettore ELISA per la misurazione
- ELISA competitivo diretto (citocromo c)
- Incubare l'anticorpo primario nelle provette
Il test ELISA è un test immunoassorbente legato all'enzima che utilizza anticorpi o antigeni accoppiati a un enzima specifico per aiutare a determinare la concentrazione di anticorpi o antigeni. Se sta assumendo un test ELISA e non è possibile utilizzare anticorpi specifici per ottenere i risultati, viene suggerito un ELISA competitivo poiché utilizza un antigene coniugato a un enzima invece dell'anticorpo e un diverso metodo di rilevazione.
Rilevamento tramite cambi di colore
Un protocollo comune per l'ELISA competitivo consiste nell'utilizzare un anticorpo primario non marcato e purificato. L'anticorpo riveste i pozzetti di una piastra per microtitolazione e viene incubato con standard sconosciuti. Un immunogeno viene quindi aggiunto al coniugato con l'anticorpo primario, che si legherà ai siti di anticorpi che non sono ancora occupati. Viene quindi utilizzato un substrato per creare un cambiamento di colore per misurare la concentrazione di legame.
Utilizzo di un lettore ELISA per la misurazione
Utilizzare una piastra di polistirene da microtitolazione e aggiungere l'anticorpo primario a ciascun pozzetto. Per ottenere il massimo legame, riempire il pozzetto con un microgrammo dell'anticorpo. Incubare la piastra per quattro ore a temperatura ambiente. Aggiungere l'anticorpo primario di cattura e lavare i pozzetti con PBS (soluzione salina tamponata con fosfato). Incubare le piastre con tampone di bloccaggio per due ore a temperatura ambiente. Lavare nuovamente i pozzetti con PBS e aggiungere gli standard. Posizionare la soluzione di antigene-coniugato nei pozzetti e incubare di nuovo per due ore. Lavare di nuovo la piastra con PBS quattro volte. Aggiungere il substrato e misurare le densità alla lunghezza d'onda specifica utilizzando un lettore ELISA.
ELISA competitivo diretto (citocromo c)
Per un ELISA competitivo diretto, è necessario eseguire un'analisi della diluizione del siero per l'antigene che si sta utilizzando nell'esperimento. La piastra per microtitolazione viene quindi rivestita con citocromo c e incubata per una notte. La porzione ELISA del dosaggio viene quindi eseguita aggiungendo il reagente bloccante e l'anticorpo secondario. I risultati dell'assorbanza vengono letti con un lettore di micropiastre.
Incubare l'anticorpo primario nelle provette
In questa procedura, l'anticorpo primario viene incubato in provette in cui l'antigene di interesse si lega ad esso. I campioni vengono quindi aggiunti ai pozzetti delle piastre per microtitolazione e incubati. I pozzetti vengono quindi lavati per rimuovere eventuali complessi antigene-anticorpo non legati e quindi viene aggiunta la soluzione di blocco per impedire al secondo anticorpo di legarsi ai pozzetti. L'anticorpo secondario viene quindi letto su un lettore di piastre per ottenere i risultati.